■本報記者 韓揚眉

剪切、復制、粘貼，消除不需要的基因片段，換上想要的基因片段，這就是基因組編輯技術。這把“基因剪刀”被科學家應用在各種動植物的基因修復與改造中，為醫(yī)學、健康、農(nóng)業(yè)等帶來了突破性革命。

為了更精準地實現(xiàn)基因組編輯，近年來，科學家不斷探索更多方法發(fā)展基因組編輯技術。

中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所研究員高彩霞團隊與中國科學院院士李家洋團隊合作開發(fā)了高效設計pegRNA，以及提高植物引導編輯效率的新策略，為實現(xiàn)植物基因組功能解析和作物精準育種提供了強有力的技術支撐。相關研究成果近日在線發(fā)表于《自然—生物技術》。

更精準的“夢想”

2019年10月，美國哈佛大學教授劉如謙團隊開發(fā)了全新的基因組引導編輯技術（Prime Editing）。該技術能夠在基因組的靶位點處實現(xiàn)片段的精準插入、刪除及堿基的任意替換，被稱為是“超越CRISPR”的重大突破。

引導編輯系統(tǒng)由兩部分構成：一是nCas9（H840A）與工程化改造的逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）組成的融合蛋白；二是包含PBS序列和RT模板序列的pegRNA。

2020年，高彩霞團隊擴展了引導編輯技術的應用，首次在水稻和小麥中成功建立并優(yōu)化了適用于植物的引導編輯器（PPE），為實現(xiàn)農(nóng)作物精準基因組編輯提供了技術支撐。

“目前的引導編輯器在植物中的工作效率依舊偏低，需要進一步優(yōu)化?！备卟氏几嬖V《中國科學報》，“我們之前的研究發(fā)現(xiàn)植物引導編輯效率很大程度上受到PBS序列和RT模板序列的影響，這暗示著對pegRNA序列進行合理設計有助提高引導編輯效率?！?/p>

兩種新策略

如何提升引導編輯效率并快速獲取高效形式的pegRNA，是植物引導編輯技術亟須解決的問題。

一開始，研究人員篩選了高效形式的pegRNA，并希望能找到一般性規(guī)律。 然而，事與愿違。常規(guī)實驗方法費時費力，限制了引導編輯技術在植物中的應用。

于是，研究人員另辟新路。

由于引導編輯系統(tǒng)的PBS序列與非靶標鏈結(jié)合是起始逆轉(zhuǎn)錄過程的重要條件，而熔解溫度（Tm）決定了兩條鏈結(jié)合的緊密程度，因此他們推測PBS的Tm值有可能對引導系統(tǒng)的編輯效率有重要影響。

為驗證推測，研究人員在18個內(nèi)源位點進行了測試。結(jié)果表明，當PBS的Tm值為30℃左右時，引導編輯效率在多數(shù)水稻內(nèi)源位點上達到最高，并且隨著溫度的增高或降低均呈現(xiàn)遞減的趨勢。這也驗證了他們的猜想。

研究人員還設想，為一個DNA位點的正鏈和負鏈各設計一個pegRNA，利用DNA兩條鏈之間存在的反向互補序列，同時“啟動”細胞中的其他修復途徑，共同提高引導編輯系統(tǒng)效率。

他們在15個水稻內(nèi)源位點測試了該策略。結(jié)果表明，該策略與分別遞送單個pegRNA方法相比效率平均可以提升3倍。他們將該改進策略命名為“雙pegRNA策略”。

另外，實驗還表明，運用SpG變體可以進一步拓展雙pegRNA策略的編輯范圍。

建立新平臺

對于這一成果，國際同行專家給出了高度評價：“鑒于引導編輯技術的迅猛發(fā)展，該工作將對基因組編輯領域產(chǎn)生很大影響?！?/p>

“pegRNA的設計相對復雜。如何建立一個平臺，幫助科研人員針對所需位點進行合理的設計，并構建高效的引導編輯策略，以方便大家使用，在這方面李家洋團隊非常有經(jīng)驗。”高彩霞說。

為此，基于上述兩個策略，研究人員開發(fā)了植物pegRNA設計網(wǎng)站PlantPegDesigner。

該網(wǎng)站可以提供一系列參數(shù)供使用者根據(jù)需要進行個性化選擇，并可以推薦完整的pegRNA選擇、設計與構建方案，方便使用者快速篩選高活性pegRNA。實驗結(jié)果表明，與常規(guī)設計方案或其他pegRNA設計網(wǎng)站相比，該網(wǎng)站設計的pegRNA具有更高的編輯效率。

專家指出，實現(xiàn)重要農(nóng)作物精準基因組編輯對加快農(nóng)作物遺傳改良進程具有重要意義。下一步，研究團隊將繼續(xù)優(yōu)化策略，提升網(wǎng)站平臺，為作物品種改良等提供更高效、精準的新工具。

相關論文信息：

https://doi.org/10.1038/s41587-021-00868-w